Como Escolher Enzimas de Restrição

As enzimas de restrição são enzimas que cortam DNA de cadeia simples ou dupla. Cada enzima de restrição possui uma seqüência específica de nucleotídeos, chamada de sítio de restrição, que reconhece e corta. Enzimas de restrição são usadas para sequenciamento de DNA, análise mutacional e clonagem e amplificação de DNA. Os cientistas usam enzimas de restrição para inserir genes de interesse em vetores de expressão, moléculas de DNA que podem se replicar separadamente do DNA cromossômico. O vetor contendo o gene de interesse pode então ser introduzido em uma cepa bacteriana para expressão e caracterização de proteínas.

Identifique os sítios de enzimas de restrição em seu vetor observando um mapa de restrição. O mapa de restrição lhe dirá quais enzimas irão cortar seu vetor e onde.

Escolha uma enzima de restrição que também tenha um sítio presente na inserção de seu gene, observando a seqüência do inserir. Certifique-se de que o site de restrição esteja em uma posição em sua inserção que esteja fora do gene de interesse, para que você não perca nenhuma parte do gene.

Verifique se não há duplicatas do gene. site de restrição em qualquer lugar no seu gene inserir ou vector. Isso causará vários cortes em seu DNA e fornecerá dados enganosos.

Tente escolher enzimas de restrição que cortam com extremidades coesivas, em vez de pontas sem ponta. As extremidades pegajosas ocorrem quando a enzima corta o ADN de cadeia dupla de uma maneira escalonada, deixando uma única saliência encalhada que facilita a fixação com uma inserção cortada da maneira oposta. Extremidades embotadas ocorrem quando o DNA de cadeia dupla é cortado de uma maneira suave, e estas são mais difíceis de serem anexadas.

Escolha uma enzima de restrição diferente para ambas as extremidades de sua inserção para garantir isso é inserido no vetor na orientação adequada e para garantir que o vetor não se reconecte a si mesmo.

Tente escolher duas enzimas de restrição que funcionem bem no mesmo sistema de buffer e temperatura . Se isso não for possível, execute cada digestão separadamente.

Dica

Alguns programas da Web foram desenvolvidos para identificar rapidamente os locais de restrição em uma sequência de DNA. Um tal programa é de New England BioLabs.

Coisas Necessárias

Sequência de inserir gene

Mapa de restrição para vetor de escolha

Lista de enzimas de restrição e seus locais de corte

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