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Como teste para Nucleic Acids

Testes de ácidos nucleicos é realizada em diagnósticos médicos , a fim de detectar agentes patogénicos , tais como vírus ou bactérias . Estes testes são muito mais rápido e, portanto, permitir que um médico para iniciar o tratamento de um paciente que normalmente teria que esperar pela confirmação da infecção utilizando ensaios baseados em anticorpos mais longas e tediosas . O processo é também conhecido como um ensaio de amplificação de ácido nucleico , e inclui um método conhecido como " amplificação da transcriptase reversa " pela reação em cadeia da polimerase. Uma vez que este é um procedimento científico altamente especializado, conhecimento avançado e experiência em técnicas de biologia molecular e da teoria é necessário. Coisas que você precisa
tubos PCR
PCR termociclador
pipetas e filtro dicas
Luvas
Células
Trizol ou outro reagente extração de RNA
tampão PCR
Taq polimerase
primers de RT-PCR em uma concentração mg /ml
água RNase - livres de dNTPs MgCl2

primers aleatórios em 1,8 mg /ml de concentração
SuperScript II transcriptase reversa

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transformação e preparação de RNA
um

células colheita com um reagente de extração de RNA , como Trizol . 1 ml , é suficiente para recolher células a partir de um poço de uma placa de seis cavidades de cultura de tecidos . As células são cuidadosamente pipetado cima e para baixo para homogeneizar -los e , em seguida, realizar o procedimento de extração , conforme descrito na Trizol folha de dados. Resumidamente , extrai-se com clorofórmio , seguida de centrifugação para separar as fases de DNA , proteínas e RNA . Recuperar apenas a fase RNA incolor e precipitar que com isopropanol. Após a incubação, centrífugas que e limpar o pellet resultante com várias lavagens de etanol . Em seguida, ressuspender o sedimento em água RNase -free.
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Para a transcrição reversa , desnaturar exatamente 5 microgramas de RNA a 65 graus Celsius em 10 microlitros ( ul ) volume de água livre de RNase , em seguida, rapidamente colocar em gelo . Para cada reacção , combinar 10 ul do RNA , 3 ul de tampão de reacção de PCR 10X , 2,5 ul de dNTP 10 milimolar , 6 l de 25 milimolar de cloreto de magnésio , 1 ul de iniciadores aleatórios de 1,8 miligrama por mililitro de concentração , e 0,5 ul de SuperScript II enzima transcriptase reversa . Completar cada reação com 17 ul de água RNase -free. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 10 minutos e , em seguida, a 42 graus Celsius durante uma hora para produzir o cDNA , em seguida, desnaturar a 95 graus Celsius e rapidamente gelo para parar a reacção .
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para uma reacção em cadeia da polimerase , uma vez mais criada uma mistura de reacção em tubos de 0,5 ml através da combinação de 6 ul de cDNA preparada na reacção de transcrição reversa , 1,5 ul de tampão de reacção de PCR 10X , 0,2 microlitros de polimerase Taq , 0,5 microlitro de iniciador reverso e também de primer para a frente, em seguida, cubra -se cada tubo com 10,3 ul de água RNase -free. Para executar as reacções , configurar um termociclador (por exemplo, uma máquina que realiza reacções em cadeia de polimerase ) para 30 ciclos como se segue : 95 graus Celsius durante 0,5 minuto para desnaturar , seguido de 60 graus Celsius durante 45 segundos para emparelhamento, e, finalmente, 72 graus Celsius por 1 minutos para estender a transcrição sintetizada.