casa |  | Informação em Saúde >  | setor de Saúde | Hospitais

Como linha para cima DNA para Análise

? Eletroforese em gel de agarose é o método mais comum de análise de fragmentos de DNA visual, que permite que os técnicos fragmentos de DNA visualmente DISCERN com base no tamanho . O gel de agarose sustenta um campo magnético e , uma vez que o ADN tem carga negativa , que se move no sentido da extremidade positiva do campo magnético . Fragmentos de DNA menores movem-se mais rapidamente através do gel e fragmentos maiores se movem mais lentamente. Os fragmentos de DNA são coradas com fluorescência com um agente de intercalação conhecido como brometo de etídio . Isto permite a comparação de várias amostras de ADN a electroforese em um gel . Coisas que você precisa
em gel de agarose , 0,7 por cento a 2 por cento
Tris- borato -EDTA (TBA) , tris -acetato -EDTA ( TAE ), acetato de sódio lítio (LA) , ácido bórico tampão ( SB)
brometo de etídio
Gel corante carregamento
bandeja Gel
Eletroforese câmara
Luvas
óculos de proteção
Pipeta
Eletroforese pente
mostrar mais instruções
Preparar um frasco cónico de 0,7 por cento do gel de agarose
1

Pesar 0,7 gramas de pó de agarose e em seguida, coloque em uma grande ( 250 ml) .
2

Adicione 100ml de um tampão 1X ( força regular ) ( TAE , TBE , SB ou tampão LB ) para o erlenmeyer contendo o pó de agarose
3

microondas ou calor. usando um bico de Bunsen por aproximadamente um minutos até que a solução se torne clara e a agarose se dissolva.
4

Retirar o balão da fonte de calor e deixe-o esfriar para 55 a 60 graus Celsius.
5

Adicionar 1 ul ( microlitros ) de brometo de etídio à solução de agarose arrefecida utilizando uma pipeta de tamanho adequado , geralmente de 1 ml. Agitar a solução para misturar .
6

Despeje o gel lentamente na placa de gel , assegurando que não há a formação de bolhas durante este processo . Se não há bem fornecidos barragens com bandeja de gel , use fita adesiva para formá-los .
7

Coloque um pente cuidadosamente eletroforese em gel , garantindo uma posição firme e na orientação correta . Pentes de electroforese pode variar grandemente em número de dentes que têm. Deixar o gel assentar durante cerca de 25 minutos
8

submergir o gel no mesmo tampão usado para preparar a solução agaorse - . Neste caso , um tampão 1X . Submergir o gel em até 5 ml de tampão de corrida .
Preparação e Carregamento de DNA no gel de agarose para Análise
9

Transferência de 5 a 10 mL de sua amostra ( s ) a partir de seus tubos de reacção para tubos frescos . No caso de você querer usar a mistura de reacção inteiro, um novo tubo não é necessário.
10

Adicionar tampão de carregamento 0,2 X para cada um de seus tubos de amostras frescas contendo sua amostra de DNA para o carregamento.

11

Retire o pente de electroforese lentamente , garantindo que você não quebrar o gel ou criar qualquer espaço entre o fundo do gel ea bandeja de gel.
12

Adicione cinco a 12 mL de um marcador de DNA adequado para o primeiro poço criado pelo pente de electroforese . Seja ou não um marcador de DNA é apropriada depende do tamanho dos fragmentos que você está esperando de sua amostra.
13

carga de cinco a 10 mL de suas amostras para os poços restantes e adicione um igual quantidade do mesmo marcador de DNA para o bem final.
14

Coloque os eletrodos na câmara de eletroforese , ligando os fios nas tomadas corretas para a câmara e definir o eletrodo para 50 a 150 V.

15

Permitir que o gel de correr para uma a quatro horas .
análise dos resultados
16

Retire o gel da câmara de gel e colocá-lo quer em um quarto de UV para a identificação visual, ou lugar em uma máquina que é capaz de tirar uma fotografia do gel.
17

Meça a distância marcadores da migração em seus poços.

18

traçar as distâncias em relação ao tamanho das bandas no papel milimetrado semilog e desenhar uma melhor linha de ajuste.
19

Calcule as distâncias de suas bandas desconhecidas.

20

Estimar os tamanhos de suas bandas desconhecidas , traçando uma linha a partir da distância percorrida por suas bandas desconhecidas que atende a linha de melhor ajuste.
21

Desenhe outra linha a partir deste ponto de encontro para o eixo tamanho.