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Por que você precisou lavar os poços após cada etapa?

Lavar os poços da microplaca após cada etapa em vários ensaios bioquímicos e de biologia molecular, como ELISA (ensaio imunoenzimático), isolamento de DNA/RNA, PCR e Western Blotting é uma parte essencial do protocolo experimental. O objetivo das etapas de lavagem é remover reagentes residuais, componentes de reação ou quaisquer contaminantes que possam interferir nas etapas subsequentes ou afetar a precisão e a especificidade do ensaio.

Aqui estão alguns motivos pelos quais as etapas de lavagem são necessárias:

Remoção de substâncias não ligadas: As etapas de lavagem após a adição de reagentes ou anticorpos ajudam a remover quaisquer substâncias não ligadas, como excesso de anticorpos, moléculas de ligação inespecíficas ou componentes de reação que não são capturados ou ligados à fase sólida. Isto garante que o sinal de detecção seja específico e livre de interferência de fundo.

Minimizando a contaminação cruzada: As etapas de lavagem reduzem efetivamente o risco de contaminação cruzada entre amostras. Isto é particularmente importante quando múltiplas amostras são processadas simultaneamente, pois evita o transporte de componentes de reação ou contaminantes de um poço para outro. A lavagem ajuda a manter a integridade e a precisão dos resultados de amostras individuais.

Remoção eficiente de substâncias interferentes: A lavagem é necessária para remover substâncias que possam interferir nas etapas subsequentes. Por exemplo, num ensaio ELISA, a lavagem ajuda a eliminar complexos conjugados-anticorpos não ligados, reduzindo assim o desenvolvimento da cor de fundo e aumentando a especificidade da reacção colorimétrica. Na PCR, a lavagem remove nucleotídeos, primers e polimerases de ciclos de amplificação anteriores, minimizando o risco de contaminação por transferência e garantindo uma amplificação precisa no próximo ciclo.

Padronização e reprodutibilidade: Seguindo procedimentos de lavagem padronizados, os pesquisadores garantem que as condições sejam consistentes entre os experimentos e entre diferentes laboratórios. Essa consistência é crítica para a obtenção de resultados confiáveis ​​e reprodutíveis.

O procedimento de lavagem pode envolver o uso de uma pipeta multicanal ou de um lavador automático de placas para dispensar e aspirar o tampão de lavagem. O tampão de lavagem é tipicamente uma solução salina tamponada que se assemelha à composição do tampão original utilizado no ensaio, mas não contém quaisquer componentes de reação.

A lavagem adequada sem lavagem excessiva é crucial. A lavagem excessiva pode resultar na perda de componentes essenciais ligados à fase sólida e afetar a sensibilidade do ensaio. Portanto, os protocolos de lavagem são cuidadosamente projetados para alcançar a remoção ideal de substâncias indesejadas, preservando ao mesmo tempo a integridade das moléculas imobilizadas ou analitos de interesse.