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Que métodos podem ser usados ​​para estudar as interações proteína-proteína?

Vários métodos podem ser usados ​​para estudar interações proteína-proteína. Aqui estão algumas técnicas comumente usadas:

1. Co-imunoprecipitação (Co-IP) :Co-IP é uma técnica amplamente utilizada para estudar interações proteína-proteína. Envolve a imunoprecipitação de uma proteína (proteína isca) de um lisado celular usando um anticorpo específico para a proteína isca. O complexo proteico imunoprecipitado é então analisado para identificar outras proteínas (proteínas de presa) que interagem com a proteína da isca. O Co-IP pode ser seguido por vários métodos de análise a jusante, como Western blotting, espectrometria de massa ou coloração por imunofluorescência.

2. Ensaios suspensos :Os ensaios pull-down baseiam-se no princípio da cromatografia de afinidade. Uma proteína de isca é imobilizada em um suporte sólido (tal como esferas magnéticas ou resina de agarose) através de ligação covalente ou fusão com uma etiqueta (por exemplo, GST ou etiqueta His). O lisado celular ou mistura de proteínas purificadas é então incubado com a proteína de isca imobilizada. Após a lavagem para remover proteínas não ligadas, as proteínas interagentes (proteínas de presa) são eluídas e analisadas.

3. Transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) :FRET é uma técnica que mede a transferência de energia entre dois fluoróforos próximos (doador e aceitador). Quando os fluoróforos doador e aceitador estão próximos (normalmente entre 10-100 Å), a excitação do fluoróforo doador resulta na emissão de luz pelo fluoróforo aceitador. Esta transferência de energia pode ser quantificada e usada para monitorar interações proteína-proteína. O FRET pode ser implementado de várias maneiras, incluindo rotulagem de proteínas com fluoróforos específicos ou usando proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (por exemplo, GFP e RFP).

4. Análise de Interação Biomolecular (BIA) :BIA, também conhecida como ressonância plasmônica de superfície (SPR), é uma técnica sem rótulo que mede alterações no índice de refração na interface de uma lâmina de vidro e um líquido fluindo. Uma das proteínas interagentes é imobilizada na superfície do vidro e a outra proteína é passada sobre a superfície. A interação entre as proteínas leva a alterações no índice de refração, que podem ser detectadas e quantificadas. A BIA pode fornecer informações sobre a afinidade de ligação e a cinética das interações proteína-proteína.

5. Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) :ITC é uma técnica que mede a mudança de calor associada à interação entre duas moléculas. Quando as proteínas interagem, o calor é liberado (exotérmico) ou absorvido (endotérmico). O ITC pode quantificar a afinidade de ligação (Kd) e parâmetros termodinâmicos, como alteração de entalpia (ΔH) e alteração de entropia (ΔS), de interações proteína-proteína.

6. Matrizes de interação de proteínas :Matrizes de interação de proteínas envolvem a triagem de alto rendimento de interações proteína-proteína em formato de microarranjo. Milhares de proteínas ou peptídeos diferentes são imobilizados em uma superfície sólida, e a ligação de uma proteína específica de interesse é detectada usando anticorpos marcados ou outros métodos de detecção. Esta técnica permite análises rápidas e em larga escala das interações proteína-proteína.

7. Ensaio de Levedura Dois-Híbridos (Y2H) :O ensaio Y2H é um método genético usado para identificar interações proteína-proteína em células de levedura. Envolve a fusão das sequências de codificação de duas proteínas em dois domínios diferentes de um fator de transcrição. Se as duas proteínas interagirem, o fator de transcrição é reconstituído, levando à expressão de um gene repórter. As interações positivas são identificadas com base no crescimento de células de levedura em meios seletivos ou ensaios colorimétricos.

A escolha do método para estudar as interações proteína-proteína depende das proteínas específicas de interesse, da disponibilidade de reagentes e equipamentos e do nível de informação desejado. Combinações dessas técnicas também podem ser empregadas para obter insights abrangentes sobre as interações proteína-proteína.